在食品、医药、生物学、生物化学中常用到蛋白质含量的测定，随着分析手段的不断进步，蛋白质含量的测定方法也正在向准确、快速的方向发展。根据蛋白质的性质，测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，如含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量，通常采用经典的凯氏定氮法[1，2]，目前已有采用红外连续消化、自动蒸馏和自动滴定装置的自动凯氏定氮仪；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性基团、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量，有水杨酸比色法[3]、双缩脲法[4]、皮尼克法、Bradford 检测法（考马斯亮蓝染色法）[5]、Lowry 检测法（FoLin－酚试剂法）、二喹啉甲酸（BCA）检测法[6]、紫外吸收法、荧光探针法[7]、近红外透射光谱法[8，9]、高效液相色谱法及毛细管电泳分析法。此外，还有更为先进的罗丹明 6G 生物探针[10]、高光谱遥感技术[11]等测定蛋白质含量的方法。基于凯氏定氮法的准确度和普遍性，本实验采用凯氏定氮法，并对蒸馏后产物的处理方法进行了改进，将蒸出液用纳氏试剂进行比色（以下称该法为凯氏比色法），快速确定氮含量，提高了定氮实验的准确性和可操作性，避免了凯氏定氮法中盐酸标准试剂浓度确定的麻烦操作、滴定过程终点不好控制等问题，大大减轻劳动强度与劳动时间。实验中利用NH4Cl作基准物，将改进法测定结果与实际氨氮加入量进行比较，结果表明改进法对测定蛋白质含量是可行的。

　　1 实验部分
　　
　　1.1 实验仪器与药品
　　凯氏定氮装置、101-1A 型数显式恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司）、液晶显示分析天平（上海天平仪器厂）、722分光光度计（上海天平仪器厂）；干酪素（光谱纯）、纳氏试剂。
　　1.2 实验步骤
　　1.2.1 纳氏试剂比色法工作曲线确定
　　称取3.819g在100℃条件下干燥过的无水NH4Cl，用去离子水定容至1 000ml，氨氮浓度为1.0mg/ml。取出10.00ml该溶液转入1 000ml容量瓶中定容，则此时氨氮浓度为0.01mg/ml，分别取此溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、7.00、10.00ml于50ml 比色管中，加无氨水至标线，先加入1.00ml酒石酸钾钠溶液充分摇匀，再加入1.5ml 纳氏试剂摇匀，10min后，以空白试剂为参比，用1cm比色皿在420nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
　　1.2.2 凯氏滴定法实验步骤
　　1.2.2.1 消化
　　准确称取2.000g干酪素，放入250ml凯氏烧瓶中，加入混合消化液（硫酸：双氧水：水＝2：3：1）20ml，催化剂为1：1的硫酸钠和硫酸铜2g。将烧瓶置于电热套中加热消化，先低温加热，10min 后升温，使瓶内液体微沸至呈蓝绿色透明，继续保持微沸，待消化彻底，转移到容量瓶定容500ml，待用。以后每次取2ml液体测定。
　　1.2.2.2 蒸馏
　　将凯氏烧瓶按蒸馏装置连好，以5.0ml硼酸为吸收液，于其中加入3 滴甲基红-溴甲酚绿指示剂，从漏斗中加入40％的NaOH溶液2ml，边加边摇动凯氏瓶，直至瓶内液体变为深蓝色，再加热蒸馏至氨全部蒸出。
　　1.2.2.3 滴定
　　将上述馏出液用0.119 1mol/l盐酸标准溶液（无水碳酸钠滴定）滴定硼酸吸收液，至蓝色变为微红色即为终点。记录盐酸溶液的用量，同时做一空白对照组。
　　1.2.3 结果计算
　　凯氏滴定法滴定值计算公式：

　　式中：C——标准盐酸浓度0.119 1mol/l；
　　V1——滴定试样用标准盐酸体积（ml）；
　　V0——滴定空白样用标准盐酸体积（ml）。
　　比色法吸光度值确定蛋白质含量公式：
　　N%=(Y-K)X250/(bX样品重)X100%
　　式中：Y——吸光度A420；
　　K——工作曲线截距；
　　b——工作曲线斜率。

　　2 结果与讨论

　　2.1 纳氏试剂比色法吸光度标准曲线
　　y= 0.094 86+0.216 29x，R=0.999 35
　　2.2 样品测定结果
　　用凯氏滴定法和凯氏比色法分别测定5组干酪素样品，结果如表1。

　　由表1中数据可知，5组测定结果的平均值相对偏差为1.395%，说明两种方法的测定结果的偏差较小，有很好的一致性。

　2.3 凯氏比色法准确性验证
　　2.3.1 NH4Cl溶液氨氮含量测定